İlan zəhərinin tərkibində karboksil ester bağlarını hidroliz edən fermentlər var.Hidroliz üçün substratlar fosfolipidlər, asetilkolin və aromatik asetatdır.Bu fermentlərə üç növ daxildir: fosfolipaz, asetilkolinesteraza və aromatik esteraza.İlan zəhərində olan arginin esterazı sintetik arginin və ya lizini də hidrolizə edə bilər, lakin o, əsasən təbiətdəki protein peptid bağlarını hidroliz edir, ona görə də proteazaya aiddir.Burada müzakirə olunan fermentlər yalnız ester substratlarına təsir edir və heç bir peptid bağına təsir göstərə bilməzlər.Bu fermentlər arasında asetilkolinesteraza və fosfolipazanın bioloji funksiyaları daha mühümdür və tam öyrənilmişdir.Bəzi ilan zəhərləri p-nitrofenil etil esteri, a - və ya P-naftalin asetatı və indol etil esterini hidroliz edə bilən güclü aromatik esteraz aktivliyinə malikdir.Bu fəaliyyətin müstəqil bir ferment və ya karboksilesterazın məlum yan təsiri tərəfindən istehsal edilib-edilməməsi, onun bioloji əhəmiyyəti bir yana qalsın, hələ də məlum deyil.Agkistrodon halys Japonicus zəhəri p-nitrofenil etil efiri və indol etil efiri ilə reaksiyaya girdikdə, p-nitrofenol və indol fenolun hidrolizatları tapılmadı;Əksinə, bu efirlər kobra Zhoushan yarımnövü ilan zəhəri və Bungarus multicinctus ilan zəhəri ilə reaksiya verərsə, onlar tez hidrolizləşəcəklər.Məlumdur ki, bu kobra zəhərləri yuxarıda göstərilən substratların hidrolizindən məsul ola bilən güclü xolinesteraz aktivliyinə malikdir.Əslində, Mclean et al.(1971) bildirmişdir ki, Kobra ailəsinə aid bir çox ilan zəhəri indol etil esteri, naftalin etil efiri və butil naftalin efirini hidroliz edə bilir.Bu ilan zəhərləri bunlardan gəlir: kobra, qara boyunlu kobra, qara dodaqlı kobra, qızıl kobra, Misir kobrası, kral kobra, qızıl kobra mamba, qara mamba və ağ dodaqlı mamba (D. aw hələ də şərq rombola çıngırtılı ilanını tanıyır.
İlan zəhəri zərdabda xolinesterazın aktivliyini təyin etmək üçün substrat olan metilindol etil esterini hidroliz edə bilir, lakin bu ilan zəhəri xolinesteraz aktivliyi göstərmir.Bu, kobra zəhərində xolinesterazadan fərqli olan naməlum esterazın olduğunu göstərir.Bu fermentin təbiətini başa düşmək üçün əlavə ayırma işinə ehtiyac var.
1, Fosfolipaz A2
(I) Ümumi baxış
Fosfolipaz qliseril fosfatı hidroliz edə bilən bir fermentdir.Təbiətdə 5 növ fosfolipaz var, yəni fosfolipaz A2 və fosfolipaz
A. , fosfolipaz B, fosfolipaz C və fosfolipaz D. İlan zəhəri əsasən fosfolipaz A2 (PLA2), bir neçə ilan zəhərində fosfolipaz B, digər fosfolipazlar isə əsasən heyvan toxumalarında və bakteriyalarda olur.Şəkil 3-11-4 bu fosfolipazların substratın hidrolizinə təsir sahəsini göstərir.
Fosfolipazlar arasında PLA2 daha çox tədqiq edilmişdir.O, ilan zəhərində ən çox öyrənilmiş ferment ola bilər.Onun substratı Sn-3-gliserofosfatın ikinci mövqeyində ester bağıdır.Bu ferment ilan zəhəri, arı zəhəri, əqrəb zəhəri və heyvan toxumalarında geniş yayılmışdır və PLA2 dörd ailə ilan zəhərində boldur.Bu ferment qırmızı qan hüceyrələrini parçalayaraq hemolizə səbəb olduğu üçün ona “hemolizin” də deyilir.Bəzi insanlar PLA2 hemolitik lesitinaz da adlandırırlar.
Ludeeke əvvəlcə ilan zəhərinin fermentlər vasitəsilə lesitinə təsir edərək hemolitik birləşmə yarada biləcəyini tapdı.Daha sonra Delezenne et al.sübut etdi ki, kobra zəhəri at zərdabına və ya sarısına təsir etdikdə hemolitik maddə əmələ gətirir.İndi məlumdur ki, PLA2 eritrosit membranının fosfolipidlərinə birbaşa təsir göstərərək eritrosit membranının strukturunu məhv edir və birbaşa hemolizə səbəb olur;O, həmçinin dolayı hemoliz yaratmaq üçün qırmızı qan hüceyrələrinə təsir edən hemolitik lesitin istehsal etmək üçün serum və ya əlavə lesitin üzərində hərəkət edə bilər.PLA2 dörd ilan zəhəri ailəsində bol olsa da, müxtəlif ilan zəhərlərindəki fermentlərin tərkibi bir qədər fərqlidir.Çınqıllı ilan (C
İlan zəhəri yalnız zəif PLA2 aktivliyi göstərdi.Cədvəl 3-11-11 Çində zəhərli ilanların 10 əsas zəhərinin PLA2 aktivliyinin müqayisəsini göstərir.
Cədvəl 3-11-11 Çində 10 ilan zəhərinin fosfolipaz VIII fəaliyyətinin müqayisəsi
İlan zəhəri
Yağların sərbəst buraxılması
Alifatik turşu,
Cjumol/mq)
Hemolitik aktivlik CHU50/^ g * ml)
İlan zəhəri
Yağ turşularını buraxın
(^raol/mq)
Hemolitik aktivlik "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
on bir
Mikrasefal göz
beş nöqtə bir sıfır
kalyspallas
8. 68
iki min səkkiz yüz
gracilis
V, kəskin
7. 56
* * #
Ofiyofaq hannah
üç nöqtə səkkiz iki
yüz qırx
Bnugarus fasctatus
7,56
iki yüz səksən
B. multicinctus
bir nöqtə doqquz altı
iki yüz səksən
Viper və russelli
yeddi nöqtə sıfır üç
T, mukrosquamatus
bir xal səkkiz beş
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Ayırma və təmizləmə
İlan zəhərindəki PLA2-nin tərkibi böyükdür və istiliyə, turşuya, qələvilərə və denaturantlara davamlıdır, beləliklə PLA2-ni təmizləmək və ayırmaq asandır.Ümumi üsul əvvəlcə xam zəhər üzərində gel filtrasiyasını həyata keçirmək, sonra ion mübadiləsi xromatoqrafiyasını həyata keçirməkdir və növbəti addım təkrarlana bilər.Qeyd etmək lazımdır ki, ion dəyişdirici xromatoqrafiyadan sonra PLA2-nin dondurularaq qurudulması aqreqasiyaya səbəb olmamalıdır, çünki dondurularaq qurutma prosesi çox vaxt sistemdə ion gücünü artırır ki, bu da PLA2-nin aqreqasiyasına səbəb olan mühüm amildir.Yuxarıda göstərilən ümumi üsullara əlavə olaraq, aşağıdakı üsullar da qəbul edilmişdir: ① Wells et al.② PLA2-nin substrat analoqu yaxınlıq xromatoqrafiyası üçün liqand kimi istifadə edilmişdir.Bu liqand Ca2+ ilə ilan zəhərində PLA2-yə bağlana bilir.EDTA əsasən eluent kimi istifadə olunur.Ca2+ xaric edildikdən sonra PLA2 ilə liqand arasındakı yaxınlıq azalır və o, liqanddan ayrıla bilər.Digərləri eluent kimi 30% üzvi məhluldan və ya 6mol/L karbamiddən istifadə edirlər.③ Kardiotoksində PLA2 izini çıxarmaq üçün PheiilSephar0SeCL-4B ilə hidrofobik xromatoqrafiya aparıldı.④ Anti PLA2 antikoru PLA2-də yaxınlıq xromatoqrafiyasını həyata keçirmək üçün liqand kimi istifadə edilmişdir.
İndiyədək çoxlu sayda ilan zəhəri PLAZ təmizlənib.Tu və başqaları.(1977) 1975-ci ildən əvvəl ilan zəhərindən təmizlənmiş PLA2-ni sadaladı. Son illərdə hər il PLA2-nin ayrılması və təmizlənməsi ilə bağlı çoxlu sayda məqalələr dərc olunur.Burada Çin alimləri tərəfindən PLA-nın ayrılması və təmizlənməsinə diqqət yetiririk.
Chen Yuancong və başqaları.(1981) Zhejiangdakı Agkistrodon halys Pallas zəhərindən üç PLA2 növünü ayırdı, bu da izoelektrik nöqtələrinə görə turşu, neytral və qələvi PLA2-yə bölünə bilər.Toksikliyinə görə neytral PLA2 daha zəhərlidir və bu, presinaptik neyrotoksin Agkistrodotoksin kimi müəyyən edilmişdir.Qələvi PLA2 daha az toksikdir, turşulu PLA2 isə demək olar ki, toksikliyi yoxdur.Wu Xiangfu et al.(1984) molekulyar çəki, amin turşusu tərkibi, N-terminal, izoelektrik nöqtə, istilik sabitliyi, ferment aktivliyi, toksiklik və hemolitik aktivlik daxil olmaqla üç PLA2-nin xüsusiyyətlərini müqayisə etdi.Nəticələr onların oxşar molekulyar çəki və istilik sabitliyinə malik olduğunu, lakin digər aspektlərdə əhəmiyyətli fərqlərə malik olduğunu göstərdi.Ferment aktivliyi aspektində turşu fermentinin aktivliyi qələvi fermentin aktivliyindən yüksək olmuşdur;Qələvi fermentin siçovulların qırmızı qan hüceyrələrinə hemolitik təsiri ən güclü olmuşdur, ondan sonra neytral ferment gəlir və turşu fermenti çətinliklə hemoliz olunur.Buna görə də, PLAZ-ın hemolitik təsirinin PLA2 molekulunun yükü ilə əlaqəli olduğu ehtimal edilir.Zhang Jingkang et al.(1981) Aqkistrodotoksin kristallarını hazırlamışlar.Tu Guangliang et al.(1983) izoelektrik nöqtəsi 7.6 olan zəhərli PLA-nın Fujian vipera rotundus zəhərindən təcrid olunaraq təmizləndiyini və onun fiziki və kimyəvi xassələrini, amin turşularının tərkibini və N-də 22 amin turşusu qalıqlarının ardıcıllığını bildirdi. -terminal təyin olundu.Li Yuesheng və başqaları.(1985) Fujianda Viper rotundus zəhərindən başqa bir PLA2-ni təcrid etdi və təmizlədi.PLA2 * alt vahidi 13 800, izoelektrik nöqtəsi 10,4 və xüsusi aktivlik 35/xnioI/miri mg。 Substrat olaraq lesitin ilə fermentin optimal pH-ı 8,0 və optimal temperatur 65 ° C-dir. LD5 siçanlara venadaxili yeridilir.0,5 ± 0,12 mq/kq təşkil edir.Bu ferment aşkar antikoaqulyant və hemolitik təsirlərə malikdir.Zəhərli PLA2 molekulu 18 növ amin turşusunun 123 qalığından ibarətdir.Molekul sistein (14), aspartik turşu (14) və qlisin (12) ilə zəngindir, lakin yalnız bir metionin ehtiva edir və onun N-terminalı serin qalığıdır.Tuguang tərəfindən təcrid olunmuş PLA2 ilə müqayisədə iki izoenzimin molekulyar çəkisi və amin turşusu qalıqlarının sayı çox oxşardır və amin turşusu tərkibi də çox oxşardır, lakin aspartik turşu və prolin qalıqlarının sayı bir qədər fərqlidir.Guangxi kral kobra ilan zəhəri zəngin PLA2 ehtiva edir.Shu Yuyan və başqaları.(1989) orijinal zəhərdən 3,6 dəfə yüksək xüsusi aktivliyə, 13000 molekulyar çəkiyə, 122 amin turşusu qalığından ibarət tərkibə, 8,9 izoelektrik nöqtəyə və yaxşı istilik sabitliyinə malik olan PLA2-ni zəhərdən təcrid etmişdir.Əsas PLA2-nin qırmızı qan hüceyrələrinə təsirinin elektron mikroskopunun müşahidəsindən, insanın qırmızı qan hüceyrələrinin membranına açıq təsir göstərdiyini, lakin keçi qırmızı qan hüceyrələrinə heç bir açıq təsir göstərmədiyini görmək olar.Bu PLA2 insanlarda, keçilərdə, dovşanlarda və qvineya donuzlarında qırmızı qan hüceyrələrinin elektroforetik sürətinə açıq-aşkar gecikdirici təsir göstərir.Chen və başqaları.Bu ferment ADP, kollagen və natrium araxidon turşusu tərəfindən törədilən trombositlərin yığılmasını maneə törədə bilər.PLA2 konsentrasiyası 10/xg/ml~lOOjug/ml olduqda, trombositlərin aqreqasiyası tamamilə maneə törədilir.Əgər yuyulmuş trombositlər material kimi istifadə olunarsa, PLA2 20 mq/ml konsentrasiyada aqreqasiyanın qarşısını ala bilməzdi.Aspirin, PLA2-nin trombositlərə təsirini maneə törədə bilən sikloksigenazanın inhibitorudur.PLA2 tromboksan A2-ni sintez etmək üçün araxidon turşusunu hidroliz edərək trombositlərin aqreqasiyasını maneə törədə bilər.Zhejiang əyalətində Agkistrodon halys Pallas zəhəri tərəfindən istehsal olunan PLA2 məhlulunun konformasiyası dairəvi dikroizm, flüoresan və UV udma yolu ilə tədqiq edilmişdir.Eksperimental nəticələr göstərdi ki, bu fermentin əsas zəncir konformasiyası digər növ və cinslərdən olan eyni növ fermentinkinə bənzəyir, skelet konformasiyası yaxşı istilik müqavimətinə malikdir və turşu mühitində struktur dəyişikliyi geri çevrilir.Aktivator Ca2+ və fermentin birləşməsi triptofan qalıqlarının mühitinə təsir göstərmir, Zn2+ inhibitoru isə əksinədir.Məhlulun pH dəyərinin ferment aktivliyinə təsir etmə üsulu yuxarıda göstərilən reagentlərdən fərqlidir.
İlan zəhərinin PLA2 ilə təmizlənməsi prosesində aşkar bir hadisə ondan ibarətdir ki, ilan zəhərində iki və ya daha çox PLA2 elüsyon zirvəsi var.Bu hadisəni aşağıdakı kimi izah etmək olar: ① izozimlərin mövcudluğuna görə;② Bir növ PLA2 müxtəlif molekulyar çəkilərə malik müxtəlif PLA2 qarışıqlarına polimerləşir, onların əksəriyyəti 9 000~40 000 diapazonundadır;③ PLA2 və digər ilan zəhəri komponentlərinin birləşməsi PLA2-ni çətinləşdirir;④ PLA2-dəki amid bağı hidroliz edildiyi üçün yük dəyişir.① Və ② yalnız bir neçə istisna olmaqla ümumidir, məsələn, CrWa/w ilan zəhərində PLA2
İki vəziyyət var: ① və ②.Üçüncü vəziyyət PLA2-də aşağıdakı ilanların zəhərində aşkar edilmişdir: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Fələstin gürzəsi, qum gürzəsi və dəhşətli çıngırtılı ilan km。.
④ halının nəticəsi elektroforez zamanı PLA2-nin miqrasiya sürətini dəyişir, lakin amin turşusu tərkibi dəyişmir.Peptidlər hidroliz yolu ilə parçalana bilər, lakin ümumiyyətlə onlar hələ də disulfid bağları ilə birləşirlər.Şərq çuxurlu çıngırdak ilanının zəhəri müvafiq olaraq a tipi və p tipi PLA2 adlanan iki PLA2 formasını ehtiva edir.Bu iki növ PLA2 arasındakı fərq yalnız bir amin turşusudur, yəni bir PLA2 molekulunda qlutamin digər PLA2 molekulunda qlutamin turşusu ilə əvəz olunur.Bu fərqin dəqiq səbəbi bəlli olmasa da, ümumiyyətlə bunun PLA2-nin dezaminasiyası ilə əlaqəli olduğuna inanılır.Fələstin gürzəsinin zəhərindəki PLA2 xam zəhərlə isti saxlanılarsa, onun ferment molekullarındakı son qruplar əvvəlkindən daha çox olacaq.C-dən ilan zəhərindən təcrid olunmuş PLA2-nin iki fərqli N-terminalı var və onun molekulyar çəkisi 30000-dir. Bu fenomen şərq almazlı çıngırtılı ilanın zəhərində PLA2-nin yaratdığı simmetrik dimerə bənzəyən PLA2-nin asimmetrik dimerindən qaynaqlana bilər. və qərb almaz arxası çıngırtılı ilan.Asiya kobrası bir çox alt növdən ibarətdir, bəziləri təsnifat baxımından çox dəqiq deyil.Məsələn, əvvəllər Kobra Xarici Xəzər yarımnövü adlanan şey indi tanınır
Bunu Xarici Xəzər dənizi kobrasına aid etmək lazımdır.Çoxlu alt növlər olduğundan və onlar bir-birinə qarışdığından, ilan zəhərinin tərkibi müxtəlif mənbələrə görə çox dəyişir və PLA2 izozimlərinin tərkibi də yüksəkdir.Məsələn, kobra zəhəri
r ^ ll növünün ən azı 9 növ PLA2 izoziminə, Xəzər kobra yarımnövünün zəhərində isə 7 növ PLA2 izoziminə rast gəlinmişdir.Durkin və başqaları.(1981) müxtəlif ilan zəhərlərində, o cümlədən 18 kobra zəhərində, 3 mamba zəhərində, 5 gürzə zəhərində, 16 zınqırovlu ilan zəhərində və 3 dəniz ilanı zəhərində PLA2 tərkibini və izozimlərin sayını öyrənmişdir.Ümumiyyətlə, kobra zəhərinin PLA2 aktivliyi çoxlu izozimlərə malikdir.Gürzə zəhərinin PLA2 aktivliyi və izozimləri orta səviyyədədir.Mamba zəhərinin və çınqıllı ilan zəhərinin PLA2 aktivliyi çox aşağıdır və ya PLA2 aktivliyi yoxdur.Dəniz ilan zəhərinin PLA2 aktivliyi də aşağıdır.
Son illərdə ilan zəhərində PLA2-nin aktiv dimer şəklində olduğu, məsələn, şərq romboforası çıngırdayan ilan (C. ilan zəhərində a və P tipli PLA2 var, hər ikisi eyni iki alt bölmədən ibarət olduğu bildirilməyib) , və yalnız dimeraza malikdir
Fəaliyyət.Shen və başqaları.həmçinin ilan zəhərinin yalnız PLA2 dimerinin fermentin aktiv forması olduğunu irəli sürdü.Məkan quruluşunun tədqiqi də sübut edir ki, qərb almaz sırtlı ilanın PLA2-si dimer şəklində mövcuddur.Balıqyeyən birləşmə
İlan zəhərinin iki fərqli PLA ^ Ei və E2 var ki, onlarda 仏 dimer şəklində mövcuddur, dimer aktivdir və onun dissosiasiya olunmuş monomeri qeyri-aktivdir.Lu Yinghua və başqaları.(1980) daha sonra E. Jayanthi və başqalarının fiziki və kimyəvi xassələrini və reaksiya kinetikasını tədqiq etdi.(1989) gürzə zəhərindən əsas PLA2 (VRVPL-V) təcrid etdi.PLA2 monomerinin molekulyar çəkisi öldürücü, antikoaqulyant və ödem təsirinə malik olan 10000-dir.Ferment PH 4.8 şərti ilə müxtəlif molekulyar çəkiyə malik polimerləri polimerləşdirə bilir və temperaturun artması ilə polimerlərin polimerləşmə dərəcəsi və molekulyar çəkisi artır.96°C-də əmələ gələn polimerin molekulyar çəkisi 53100-dür və bu polimerin PLA2 aktivliyi iki dəfə artır.
Göndərmə vaxtı: 18 noyabr 2022-ci il